Его величество коннектом: сверхзадача нейробиологии

Мозг – уникальная клеточная структура и по своему строению, и по функциям. Строение нервной системы, и головного мозга в частности, является одним из важных таксономических признаков. В конечном итоге, именно наличие у данного вида более молодых в эволюционном отношении структур мозга определяет сложность поведения животного, от дерганых, недоверчивых движений птичьей головы до значимого интеллекта лабораторной крысы или эмпатии собаки к конкретному человеку.

Но до осознания человеком всех своих функций еще далеко. Мы до сих пор упираемся в некоторые фундаментальные и технические пределы, которые не позволяют нам сделать следующий шаг в изучении мозга. Разумеется, самым желанным в настоящий момент является понимание его строения не в общих чертах, что уже было выполнено на протяжении ХХ века, а в самых точных подробностях. И мы хорошо представляем максимальный уровень точности – это определение всех взаимосвязей элементарных структурных единиц мозга – нейронов.

ЗАДАЧА

Имя этой задаче – коннектóм. То есть совокупность всех связей между всеми нейронами в мозге того или иного биологического вида, а еще точнее – подробное описание всех этих связей в любом виде: карта графов, 3D-реконструкция, схема нервных волокон с указанием их мишеней. Коннектом мозга для нейрофизиологов – это то же самое, что геном для молекулярных генетиков. Задача, решение которой носит технический характер, которую сложно, но необходимо решить, чтобы двигаться дальше и отвечать на те же базовые вопросы, что и в свое время со структурой ДНК: насколько строение консервативно между разными особями и различно между разными видами? Что из нейронных связей критически важно, а что носит взаимозаменяемый, или даже бессмысленный характер? Как осуществляется регуляция движений, создание образов, извлечение воспоминаний, мышление, мотивация – где и как генерируются и проходят соответствующие сигналы? Без базовой опоры в виде понимания структуры мозга очень многие исследования его локальных функций так и останутся лоскутным одеялом не связанных между собой гипотез. И наоборот, увидев какие-либо неожиданные связи между отделами мозга, мы можем изучить их более внимательно и прицельно.

ПРОБЛЕМЫ

Их больше, чем мы можем в данный момент переварить. Все проблемы можно условно сгруппировать по их фундаментальным причинам, и многие из них не имеют решения в обозримом будущем, но как минимум перечислить их легко.

Масштаб

Даже грубые математические прикидки дают представление о чрезвычайной масштабности проблемы описания мозга. В научно-популярных текстах мозг часто сравнивают с компьютером, но эта аналогия при подробном рассмотрении оказывается неудачной. Это становится понятно, если привести количественные оценки того, насколько сложна организация нервной системы.

То, как схематически изображают нейроны, не отражает истинного количества нейритов (отростков), которыми они могут обладать. У наиболее разветвленных нейронов число дендритов может доходить до тысяч, а на дендритах есть структуры, называемые шипиками, способные образовывать самостоятельные синаптические связи.
То, как схематически изображают нейроны, не отражает истинного количества нейритов (отростков), которыми они могут обладать. У наиболее разветвленных нейронов число дендритов может доходить до тысяч, а на дендритах есть структуры, называемые шипиками, способные образовывать самостоятельные синаптические связи.

Структурная единица мозга, нейрон, не является аналогом транзистора в процессоре, и не обладает бинарной логикой. Соответственно, нейроны в мозге не образуют логические структуры вроде NAND, XOR и т. п. А все потому, что каждый нейрон имеет один аксон, являющийся источником сигнала, и десятки, и даже тысячи дендритов, являющихся условно приемниками сигналов от соседних нейронов. Кроме того, нейрон является в некоторой степени сумматором сигналов, поскольку возникновение потенциала действия, как правило, требует наличия возбуждающего сигнала от нескольких дендритов одновременно. Такая недетерминированная логика уже сильно усложняет задачу классификации того или иного нейрона как некоего логического элемента в живой нейросети.

Множество «вводов» в нейрон сразу же на порядки увеличивает масштаб коннектома. Известно, что у пчелы насчитывается немногим менее миллиона нейронов, а вот число связей между ними оценивается уже в миллиард. Даже учитывая то, что передача нервного сигнала редко осуществляется по иному пути, чем аксон-дендрит, такой размер делает очень сложной задачей даже описание и хранение информации о коннектоме, не то что динамическое моделирование всех взаимодействий нейронов и прохождения нервных импульсов.

Даже у маленькой пчелки есть нервная система с головным мозгом (показана фиолетовым). А у самого распространенного лабораторного животного – крысы – в мозгу 200 млн клеток и сотни миллиардов связей.
Даже у маленькой пчелки есть нервная система с головным мозгом (показана фиолетовым). А у самого распространенного лабораторного животного – крысы – в мозгу 200 млн клеток и сотни миллиардов связей.

У взрослого человека количество нейронов только в коре (наиболее интересной части мозга, которая отвечает не за консервативные вещи вроде регуляции движений или температуры тела, а за зрительный анализ, речь, мышление, черты личности) составляет более 16 миллиардов. Простое перечисление и описание всех этих нейронов займет эксабайты информационной емкости, которыми нужно будет ворочать для малейшей задачи классификации или моделирования. И это еще без учета трудоемкости самого получения и ввода в компьютер такого объема первичных данных. Уже сейчас понятно, что чтобы подступиться к этой абстрактной проблеме, потребуются серьезные мощности суперкомпьютеров и колоссальное количество человеко-часов.

Доступность

Здесь проблема даже не в том, что мы можем разрезать для исследования мозга череп лабораторного животного, а с живым человеком так поступать неэтично. До человека, как мы уже поняли, очередь дойдет не сразу. Дело в практической невозможности «распутать» несколько миллионов проводов, уложенных в тугой клубок. Дополнительно представьте себе, что нейрон с его длинным аксоном – это даже не провод. Это скорее наполненный водой шланг с тонкими стенками толщиной в две жировые молекулы, который при повреждении лопается, спадается и быстро умирает. Размеры тела нейрона не превышают 10 микрометров, а толщина аксона и дендритов уже близка к грани оптического разрешения. Можно позволить себе такую аналогию, что хирургическое вмешательство в мозг даже микроманипулятором похоже на то, как если бы мы пытались экскаватором распутать сплетение из сотни тысяч оптоволоконных кабелей. А нам надо не просто их распутать и сосчитать, но также отследить связи каждого нейрона.

Изучение локального потенциала на мембране нейрона методом patch-clamp (слева и в центре схема, справа – фото в микроскоп) – хорошая демонстрация масштаба инструментов для микроманипуляций. Даже тонкий стеклянный электрод имеет размер кончика, сопоставимый со всей клеткой. Фото получено на клеточной культуре, где клетки образуют слой, а не трехмерную структуру, делающую неинвазивные манипуляции с выбранной клеткой невозможными.
Изучение локального потенциала на мембране нейрона методом patch-clamp (слева и в центре схема, справа – фото в микроскоп) – хорошая демонстрация масштаба инструментов для микроманипуляций. Даже тонкий стеклянный электрод имеет размер кончика, сопоставимый со всей клеткой. Фото получено на клеточной культуре, где клетки образуют слой, а не трехмерную структуру, делающую неинвазивные манипуляции с выбранной клеткой невозможными.

Значит, практически единственный наш путь – это нарезка мозга на фрагменты, срезы, воксели и кропотливое картирование, то есть, мы имеем некий «дуализм»: решая задачу пространственной структуры, мы разрушаем систему и не имеем возможность наблюдать ее в динамике и изучать прохождение сигнала. А сохраняя структуру мозга (это необходимо, если мы имеем дело с живым человеком), мы сразу же сильно теряем в пространственном разрешении. Методы визуализации вроде функциональной МРТ или тем более позитронно-эмиссионной томографии имеют свои принципиальные ограничения, упираясь как в пределы чувствительности, так и в технико-эксплуатационные сложности.

Валидность

Другой, менее очевидной проблемой, является то, насколько в природе согласуются по строению и функции структуры мозга различных видов. Насколько вообще коннектом, полученный для низших видов (а это сделать проще), будет полезен при изучении человеческого мозга?

Например, за контроль положения тела в пространстве у животных отвечает мозжечок. У птиц этот отдел особенно развит из-за сложной координации в полете. У сухопутных позвоночных мозжечок развит уже не так сильно. У собак и грызунов очень выражены по сравнению с человеком обонятельные луковицы из-за большего значения нюха в их жизнедеятельности. И это только частные примеры специализации структур мозга. Насколько вероятно, что мозг крысы можно масштабировать и спроецировать на человеческий, ведь удельный объем коры у грызунов намного меньше? Имеет ли вообще тогда смысл тратить исследовательские ресурсы на лабораторных животных, если наша конечная цель – коннектом человека?

Также большое значение имеет нейропластичность. В процессе эмбриогенеза у животных и человека закладывается множество нейронов, которые начинают активно искать свою мишень среди соседей. Те нейроны, которые не образовали связей, затем запрограммированно отмирают. Неизвестно, насколько этот процесс является строго детерминированным, то есть, насколько уникальным получается мозг каждого человека в плане структуры сформированных связей. И тем более сложно без исследования коннектома заранее оценить, каков вклад нейропластичности в процессе жизни, каковы приобретенные индивидуальные различия у каждого человека. Ясно только одно: если создавать подробную карту коннектома неконсервативных областей мозга вроде коры, то следует это делать строго для одного человека как можно в более полном объеме. Не получится сравнить и совместить карты разных людей, даже сходных возрастов и рас.

ИССЛЕДОВАНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ

На сегодняшний день существует полностью описанный коннектом нематоды Caenorhabditis elegans. Это один из наиболее изученных лабораторных модельных организмов. Из примерно 1000 клеток тела у него имеется 302 нейрона. Судьба каждой клетки в процессе индивидуального развития этого червя была изучена еще в 1970-е гг., поэтому построение его коннектома было во многом делом времени и технологий.

Изображение коннектома C. elegans. Графами показаны все изученные связи между нейронами. Интерактивная карта в формате pdf доступна по ссылке: https://wormwiring.org/pages/interactive.html. Различные типы нейронов (моторный, сенсорный, интернейрон) отмечены разными фигурами, по клику карта показывает название и нейромедиатор данного нейрона, а также его локализацию.
Изображение коннектома C. elegans. Графами показаны все изученные связи между нейронами. Интерактивная карта в формате pdf доступна по ссылке: https://wormwiring.org/pages/interactive.html. Различные типы нейронов (моторный, сенсорный, интернейрон) отмечены разными фигурами, по клику карта показывает название и нейромедиатор данного нейрона, а также его локализацию.

Все же, это коннектом лишь мелкого примитивного червя. Если сравнить мозг человека с нейросетью, запущенной на мощном сервере, то детерминированная нервная система из 302 нейронов – это даже не Arduino, а елочная гирлянда с несколькими режимами мигания. Да, эта нематода демонстрирует пищевое и половое поведение на основе термо- и световых рецепторов и хемоаттрактантов, может спать и даже приобретать никотиновую зависимость. Все это достаточно ожидаемо от организма данного уровня эволюционного развития. Но неприятность заключается в другом – исследователи не могут до конца связать поведение C. elegans с коннектомом, и это может оказаться глобальной проблемой изучения коннектома: его относительная бесполезность. Архитектура чипа оперативной памяти накладывает свои рамки на ее работу, но ничего не может сказать нам о содержимом собственных битов. А «биты» информации в нервной системе – это динамика сигналов, сложные взаимодействия нейронов. Ни в мозге нематоды, ни человека нет аналога жесткого диска, то есть накопителя битов и символов, описывающих окружающую действительность текстом, координатами или пикселями. Есть только эпизодическая память «о событии в целом», запечатленная в тончайшем рисунке связей между нейронами. С чем ассоциированы образовавшиеся конфигурации связей – вы не узнаете, если не соотнесете момент их формирования с произошедшим событием.

Что и как сейчас делается?

Однако на проблему коннектома не следует смотреть пессимистично. Все же, это чисто техническая задача, трудоемко, но решаемая для простых организмов, для отдельных небольших структур нервной системы и мозга. И польза от него может быть большой. Может быть, мы не проникнем с помощью коннектома в сознание, память, абстрактное мышление, но нам доступны для понимания системы ввода-вывода: пути сенсорных и моторных нейронов. А значит, картировать, хотя бы грубо, зрительную кору в соответствии с полями зрения в сетчатке, центры регуляции двигательной активности и другие прикладные функции организма мы теоретически сможем.

Одним из текущих проектов по картированию нейронов является EyeWire. Объектом исследования является сетчатка мыши, с помощью проекта создается база для ИИ-имаджинга нейрональных тканей. Пока же двигателем проекта являются обычные люди, как на старой доброй платформе Zooniverse. Да, любой из вас может зайти на сайт проекта и помочь в разметке нейронов (а заодно собственноручно убедиться в плотности упаковки нейритов – тугой клубок змей, который вам предстоит распутать – это кубик со стороной всего в 4-5 микрон). Базовым материалом служат ультратонкие срезы сетчатки, подкрашенные для контраста клеточных мембран и сфотографированные электронным микроскопом. Снимки организованы в Z-стеки по 256 изображений, образуя «кубики». Вам необходимо будет стрелками на клавиатуре листать фото, размечая цветом нейрон начиная от синего нейрона-«затравки». Как и во всех подобных проектах, вашу работу кросс-валидируют другие пользователи. Как утверждается в описании проекта, на картирование одного нейрона со всеми его нейритами (отростками) может уйти до двух тысяч таких «кубиков».

Интерфейс EyeWire. Справа – рабочее поле разметки, где необходимо продолжить нейрон от синего конца; слева – генерируемое трехмерное изображение с отметкой уровня среза, на котором находится пользователь.
Интерфейс EyeWire. Справа – рабочее поле разметки, где необходимо продолжить нейрон от синего конца; слева – генерируемое трехмерное изображение с отметкой уровня среза, на котором находится пользователь.

Более продвинутый проект коннектома на основе электронной микроскопии – MICrONS, проект нескольких научных групп в рамках программы госфинансирования IARPA (США). Их комбинированный подход с ИИ-обработкой изображений с электронного микроскопа и корректировкой результатов людьми позволил создать коннектом кубического миллиметра мозга лабораторной мыши. В процессе соревнования научных групп было создано два набора данных, визуализированных на сайте проекта.

Скриншот с датасета проекта Cortical mm^3 одной из команд MICrONS. Трехмерная карта маленького участка с возможностью включать отдельные нейроны и электронная фотография среза в условных цветах с выделенным телом нейрона.
Скриншот с датасета проекта Cortical mm^3 одной из команд MICrONS. Трехмерная карта маленького участка с возможностью включать отдельные нейроны и электронная фотография среза в условных цветах с выделенным телом нейрона.

Для обработки и хранения такого количества информации (снимки и трехмерные модели коннектомов потребовали хранилища петабайтов данных с быстрым доступом) в рамках проекта MICrONS университетом Джона Хопкинса была разработана специальная база данных BossDB. Репозиторий трехмерных данных доступен по адресу https://bossdb.org/projects, где также можно посмотреть открытые датасеты с многих других нейробиологических проектов.

А что, если готовить сложные ультратонкие срезы и фотографировать их терабайтами не нужно? Можно ли обойтись без этого? Некоторые исследователи утверждают, что могут добиться сходных результатов быстрее и дешевле. Метод основан на ДНК-баркодинге отдельных нейронов и последующем отслеживании молекулярных «штрихкодов» в различных областях на срезах мозга. Да, на срезах, но таких, которые гораздо проще приготовить.

Если максимально упростить всю молекулярную биологию метода, то схема выглядит так. Первоначально в отдельные участки коры головного мозга мыши инъекциями вводят вирусную конструкцию, содержащую уникальную нуклеотидную последовательность – молекулярный «штрих-код». Затем, по прошествии времени, необходимого, чтобы последовательность преодолела синаптические связи между нейронами, мозг мыши нарезают на 300-мкм слайсы (срезы шириной в весь мозг), которые затем лазером разрезают в области коры и подкорковых зон на фрагменты размером около 1 мм. Далее при помощи метода ПЦР в каждом фрагменте определяют содержание «штрих-кода» и сопоставляют его локализацию с источником. На основе полученных данных строят коннектом:

Коллаж из рисунков к статье Huang et al., 2020 (https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.05.029 ). 1 — инъекции баркода в одно из полушарий мозга. 2 — лазерная микродиссекция коры и подкорковых зон мозга на слайсах. 3 — помещение отдельных фрагментов коры, вырезанных из слайсов, в пробирки на дальнейшее секвенирование (расшифровку баркода). Справа: диаграмма совпадений баркодов (черные точки) в зонах, слева направо: ипсилатерально (в полушарии, где вводили баркоды), контралатерально (в противоположном полушарии), в подкорковой зоне. Цветом обозначены различные функциональные участки коры.
Коллаж из рисунков к статье Huang et al., 2020 (https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.05.029 ). 1 — инъекции баркода в одно из полушарий мозга. 2 — лазерная микродиссекция коры и подкорковых зон мозга на слайсах. 3 — помещение отдельных фрагментов коры, вырезанных из слайсов, в пробирки на дальнейшее секвенирование (расшифровку баркода). Справа: диаграмма совпадений баркодов (черные точки) в зонах, слева направо: ипсилатерально (в полушарии, где вводили баркоды), контралатерально (в противоположном полушарии), в подкорковой зоне. Цветом обозначены различные функциональные участки коры.

В целом, в этой области исследований наметился серьезный прогресс, и к человеческому мозгу тоже постепенно подбираются с помощью продвинутых инструментальных методов, например, специальных разновидностей МРТ. Однако даже один кубический миллиметр мозга стоит пяти лет работы и колоссального количества данных. Может быть, в мире никогда физически не будет столько носителей, чтобы записать на них коннектом хотя бы двух человек, и вычислительной мощности, чтобы их сравнить. Тем не менее, исследователи делают все, что им доступно на данный момент, а развитие технологий, безусловно, облегчит решение задачи, особенно если разбить ее на много маленьких кубиков.

Автор статьи @Vsevo10d 


НЛО прилетело и оставило здесь промокод для читателей нашего блога:

— 15% на все тарифы VDS (кроме тарифа Прогрев) — HABRFIRSTVDS.